消化液常在貼附型細(xì)胞原代培養(yǎng)或傳代培養(yǎng)過程中用來分散組織或細(xì)胞團(tuán)，以達(dá)到離散細(xì)胞，獲得細(xì)胞懸液的目的。目前常用的消化液主要有胰蛋白酶消化液、膠原酶消化液以及乙二胺四乙酸二鈉(EDTA—2Na)液。其中，胰蛋白酶溶液是使用范圍zui廣的消化液；EDTA—2Na由于消化能力較弱，常與胰蛋白酶混合使用；膠原酶則多用于原代培養(yǎng)中將特殊組織的細(xì)胞與膠原成分的分離。一般來說，這些消化液可以單獨(dú)使用，也可以按一定比例混合使用，這主要取決于處理細(xì)胞類型的不同。
1)胰蛋白酶液
胰蛋白酶(Trypsin)是一種黃白色粉末，來自牛或豬的胰臟。當(dāng)其水解蛋白質(zhì)時，作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細(xì)胞骨架，從而使細(xì)胞分離。胰蛋白酶的活力用解離酪蛋白質(zhì)的能力來表示，常用的有1：125和1：250兩種，即1份胰蛋白酶能解離125份或250份酪蛋白。胰蛋白酶適于消化細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織使用。胰蛋白酶對細(xì)胞的分離作用與細(xì)胞的類型和細(xì)胞的性質(zhì)密切關(guān)。不同的細(xì)胞對胰蛋白酶液的濃度、溫度和作用時間等要求也不一樣。一般來說，濃度越大、溫度越高、作用時間越長，對細(xì)胞的分離能力也越大，但超過一定限度就會損傷細(xì)胞。常用的胰蛋白酶液的濃度是O.25％和0．125％，作用溫度是37℃或室溫，pH 7．4左右：許多學(xué)者認(rèn)為Ca 2+ 、Mg 2+和血清的存在都會降低胰蛋白酶的活力。為使胰蛋白酶達(dá)到松弛細(xì)胞間連接和深入至單層細(xì)胞基底面及外側(cè)面，細(xì)胞在進(jìn)行胰蛋白酶液處理前，先用無Ca 2+、Mg 2+的D-Hank’s液洗滌，去除培養(yǎng)液剩留的血清、鈣及鎂離子；再用D—Hank’s液配制的胰蛋白酶液消化細(xì)胞，細(xì)胞一旦分散，即用血清培養(yǎng)液終止胰蛋白酶對細(xì)胞的繼續(xù)消化作用
胰蛋白酶液的配制方法如下：
①按實(shí)驗(yàn)需要稱取酶粉，用少量D—Hank’s液將胰蛋白酶粉調(diào)成糊狀。
②加適量D．Hank's液(橙紅色)，低速磁力攪拌(室溫和4℃間斷進(jìn)行，室溫高于30℃時要減少酶液在室溫中的攪拌時間)至酶液溶解。
③溶解后的酶液(深紅色)，濾過除菌，小瓶分裝，一20℃凍存。
2)二乙胺四乙酸二鈉液
EDTA—2Na是一種化學(xué)鰲合劑(商品名為Vorson)，它對傳代細(xì)胞有一定的解離作用，并且毒性小，使用方便。常用D．Hank’s液配成O．02％EDTA工作液，經(jīng)高壓滅菌后使用。EDTA的作用原理為：一些組織細(xì)胞，尤其是上皮組織細(xì)胞，在生長過程中需Ca 2+和Mg 2+ 參與細(xì)胞間連接，維持組織的完整性，EDTA從細(xì)胞生存環(huán)境中奪取Ca 2+和Mg 2+ ，并與這些離子形成螯合物，從而使細(xì)胞分離。因此，胰蛋白酶和EDTA混合使用可提高消化效率。EDTA不可與膠原酶聯(lián)用．因?yàn)槟z原酶的消化作用依賴于Ca2+。EDTA可損傷線粒體，它與核蛋白中的鈣、鎂離子結(jié)合，破壞核蛋白結(jié)構(gòu)。細(xì)胞長期處于無鈣環(huán)境，鉀離子濃度降低，細(xì)胞呼吸減弱。EDTA作用不受血清抑制，故消化后需*漂洗，否則會影響細(xì)胞生長。
3)膠原酶液
膠原是細(xì)胞間質(zhì)的主要成分，天然三股螺旋構(gòu)象的膠原在生理溫度和pH下，不能被其他任何蛋白酶水解，而只能被膠原酶(collagenase)降解。膠原降解后，可進(jìn)一步被其他蛋白酶降解。目前從不同組織分離的膠原酶有20多種，作用于天然膠原分子的N端1／4處，水解甘氨酸一異亮氨酸或甘氨酸一亮氨酸之間的肽鍵。不同批號或同一批號不同日期的膠原酶，其質(zhì)量都有差異。目前國內(nèi)多數(shù)實(shí)驗(yàn)室使用的膠原酶，大多是從芽孢桿菌中提取出來的。溶組織梭狀芽孢桿菌膠原酶中含梭茵肽酶(0．57～0．59 μg／mg)，具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，能破壞細(xì)胞膜上的蛋白多肽，從而改變細(xì)胞膜的通透性，因此用它消化組織時，應(yīng)采取多步收集法(20．30 min／次)，這樣才可獲得完整細(xì)胞膜和zui大活細(xì)胞收率。膠原酶在Ca 2+和Mg 2+存在下仍有活性，血清亦不能抑制其活性，故消化后應(yīng)充分漂洗。不同來源的膠原酶對于不同類型的膠原的作用強(qiáng)弱不等。
膠原酶液的配制方法如下：膠原酶用基礎(chǔ)營養(yǎng)液配制。常用劑量為200 μg/mL或0.1～0.3 mg/mL。膠原酶粉用基礎(chǔ)營養(yǎng)液調(diào)成糊狀，液體加至定量后，磁場攪拌至基本溶解。濾過除菌，按1次用量分裝，一20℃凍存。
此外還有鏈霉蛋白酶(pronase，酶活性不能被血清終止，適合消化道黏膜細(xì)胞、kupter細(xì)胞等分離)、透明質(zhì)酸酶(hyaluronidase，作用細(xì)胞外基質(zhì)透明質(zhì)酸)、DNA酶(deoxyribonuclease，作用破碎細(xì)胞釋放的DNA，酶活性可被Mg 2+和Ca 2+活化)、中性蛋白酶(dispase，用于上皮細(xì)胞分離)等。這些酶價格昂貴．只在獲取某類特殊細(xì)胞的情況下使用。由于酶作用的特異性，單一酶水解蛋白的能力有限。采用混合酶作消化劑，如利用DNA酶和胰蛋白酶分離小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，利用膠原酶、透明質(zhì)酸酶、胰蛋白酶分離大鼠心室細(xì)胞，效果會更好。
在線客服
