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白介素8ELISA檢測夾心法的實(shí)驗(yàn)方法說明
更新時(shí)間:2014-09-30   點(diǎn)擊次數(shù):707次

白介素8ELISA檢測夾心法的實(shí)驗(yàn)方法說明

    Il-8是一種分子量為8~10kD的多肽,對嗜中性粒細(xì)胞,T淋巴細(xì)胞、嗜鹼性粒細(xì)胞具有趨化作用,并可激活嗜中性粒細(xì)胞,是一種重要的炎癥介質(zhì)。在嚴(yán)重感染病人的血清中、炎癥局部滲出液中都可檢測到高水平的IL-8。此外,近年來的研究表明,Il-8可能與各種組織缺血后再灌注損傷的發(fā)生有關(guān)。研究人員采用兩株自制的單克隆抗體建立了夾心法ELISA用于檢測IL-8,敏感性可達(dá)156Pg/ml。

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    Il-8是一種分子量為8~10kD的多肽,對嗜中性粒細(xì)胞,T淋巴細(xì)胞、嗜鹼性粒細(xì)胞具有趨化作用,并可激活嗜中性粒細(xì)胞,是一種重要的炎癥介質(zhì)。在嚴(yán)重感染病人的血清中、炎癥局部滲出液中都可檢測到高水平的IL-8。此外,近年來的研究表明,IL-8可能與各種組織缺血后再灌注損傷的發(fā)生有關(guān)。我們采用兩株自制的單克隆抗體建立了夾心法ELISA用于檢測IL-8,敏感性可達(dá)156Pg/ml,操作簡單,重復(fù)性良好,可用于Il-8的基礎(chǔ)和臨床研究。
一、原理

    采用兩株識別不同表位的抗IL-8單克隆抗體,其中一株(4D7)作為包被抗體,以識別和結(jié)合待檢標(biāo)本中的Il-8,另一株作為酶標(biāo)抗體,與結(jié)合于包被抗體的IL-8的另一個(gè)表位結(jié)合并催化底物顯色。
二、試劑器材
    1. 試劑盒提供包被抗體、酶標(biāo)抗體、標(biāo)準(zhǔn)品,底物(ABTS)、96孔elisa板。
    2. 包被緩沖液、PBS、底物緩沖液配制同常規(guī)ELISA法。
三、操作步驟:
    1. 包被:pH9.5 碳酸鹽緩液稀釋4D7單克隆抗體粗提γ球蛋白至1μg/ml,加入96孔板,100μl/孔,放4℃,36小時(shí)。
    2. 封閉:0.1%吐溫PBS(Buffer A)沖洗96孔板三次,加3%BSA Buffer A(Buffer B)200μl/孔,放37℃,1小時(shí)。
    3. 加待檢樣品:Buffer A 沖洗96孔板三次,加待檢樣品及Buffer B 稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品100μl/孔,放37℃,3小時(shí)。
    4. 加酶標(biāo)抗體:Buffer A沖洗96孔板五次,3%PEG Buffer A稀釋酶標(biāo)抗體至1∶800,加入96孔板,100μl/孔,放37℃,1小時(shí)。
    5. 顯色:Buffer A沖洗96孔板五次,pH5.4檸檬酸緩沖液溶解底物(ABTS),0.2mg/ml,加3%H2O2,2μl/ml,加入96孔板,100μ/孔,室溫下或37℃顯色。
四、注意事項(xiàng):
    1. 待檢標(biāo)本如為血清,應(yīng)采用一次性容器,血液采集后盡快(6小時(shí)以內(nèi))分離血清。
    2. 封閉液或抗體稀釋液應(yīng)新鮮配制或凍存。

 

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